Antes do experimento, todos os reagentes e amostras devem ser equilibrados à temperatura ambiente; após a refusão, as amostras devem ser centrifugadas novamente e retirar o sobrenadante para teste; para reagentes ou preparação de amostras, misture e evite a formação de espuma; calibração e amostras são recomendadas para testes duplicados.

1. Add ple: adicione a solução de trabalho padrão aos dois primeiros poços por vez e adicione dois orifícios para cada concentração de solução de trabalho, 100 μ L de cada poço. As amostras a serem testadas são adicionadas a outros poços, 100 μ L por poço (para concentração de amostra acima da faixa de teste, amostra diluída com padrão e diluições de amostra). A microplaca foi revestida com filme e incubada a 37 ℃ por 90 min. Dica: Ao adicionar a amostra no fundo da microplaca, procure não tocar na parede do orifício, agite e misture suavemente, para evitar a formação de bolhas. O tempo adicional deve ser controlado em 10 minutos.

2. Anticorpo/antígeno biotinilado: descarte o líquido e agite para secar, sem lavar. 100 μL de solução de trabalho de anticorpo/antígeno biotinilado foi imediatamente adicionado a cada poço, misturado, microplaca mais revestido com filme e incubado a 37 ℃ por 1 hora.

3. Lavagem: agite o líquido no orifício, adicione 350 μL de líquido de lavagem a cada poço, mergulhe por 1-2 minutos, aspire ou sacuda o líquido na microplaca e seque em papel absorvente grosso. Repita esta etapa da placa de lavagem 3 vezes. Dica: A máquina de lavar pode ser usada aqui e em outras etapas de lavagem. Cada etapa da lavagem é essencial para o experimento.

4. Conjugado de enzima HRP: 100 μ L de solução de trabalho de conjugado enzimático por poço, misturado, revestido com filme e incubado a 37 ℃ por 30 minutos.

5. Lavagem: descarte o líquido no poço e lave a placa 5 vezes da mesma forma que no passo 3.

6. Substrato: adicione 90 μL de solução de substrato (TMB) a cada poço, misture bem, adicione o revestimento de filme e incube a 37 ℃ por cerca de 15 minutos. Observação: O tempo de incubação deve ser reduzido ou estendido de acordo com a situação real de desenvolvimento da cor, mas não deve ultrapassar 30 minutos. Ele pode ser finalizado quando um gradiente transparente aparecer no orifício padrão.

7. Rescisão: Adicionar 50 μ L de solução de terminação para cada poço para terminar a reação. Nota: a ordem de adição da solução de terminação deve ser a mesma da solução de substrato.

8. Leia: Meça imediatamente a densidade óptica (OD) de cada poço a 450 nm com um leitor de microplacas. O leitor de microplacas deve ser aberto com antecedência para configurar o procedimento de teste.

9. Após o experimento, coloque o reagente não utilizado de volta na geladeira de acordo com a temperatura de armazenamento especificada até o prazo de validade.